蛋白跑胶步骤
篇一：蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤（待改进）
1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、 设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、 RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.
4、 双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、 转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、 将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。
7、 蛋白的诱导表达。
1） 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2） SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3） 将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。
4） 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。
8、 包涵体检测。方案见 附件2
9、 如有上清表达，则扩大摇菌。
1） 取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。
2） 将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约
2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。
3） 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。
4） 将菌液6000rpm，4min，4度 离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。
10、 超声波裂解。
1） 用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。
注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。
4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。
注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解
60分钟，60分钟足够裂解。
11、 取得上清
1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。）
12、 纯化上清---摸洗脱条件。
1） 镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2） 将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流
速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。
3） 分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别
的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。
注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。
4） 加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP
管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。
5） 加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2
倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。（尿素可能对NI柱有损伤。）
注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。
13、 跑胶验证。
1） 跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相
同两块胶才会比较一致。
2） 跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、
W7、W8、W9、E1、E2、MES
3） 300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是
图没有160V好看。）
4） 考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。
5） 脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。
14、 纯化上清---收集目的蛋白
1) 将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。
2) 重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。
15、 跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。
16、 透析。
1） 配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。
2） 透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。
3） 用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其
中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。
注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。
17、 浓缩。
1） 将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。
2） 30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。
3） 每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4） 透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。
注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。
18、 超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。
1） 将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。
2） 配平。
3） 7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择
不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。
4） 加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋
白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。
5） 收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白
浓度（测量后），制备日期。
注：超滤管的使用方法见附件4
19、 蛋白浓度测定。见附件3
20、 蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。
21、 抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。
22、 注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。
23、 收集免疫血清。提取抗体。
24、 抗体效价评定。
附件1
所需溶液配方：
1)
2)
3)
4)
5) Equilibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.4 Wash Buffer（清洗缓冲液）: PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 pH 7.4 Elution Buffer（洗脱缓冲液）: PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.4 MES（再生缓冲液）: 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodium
chloride; pH 5.0。即0.3904g MES+0.5844g NaCl.
6) 透析袋处理液： 2%（w/v）碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA
7)
TIPS:1—4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS，用500ml水将
试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml，Equilibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml。
附件2
包涵体检测
1. 摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相
应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。在离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。
2. 诱导完成后，用2ml EP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。1.5mlPBS (50m M
PBS,300m M NaCl )重悬细菌。
3. 裂解细胞。 用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。裂解3s，停止6s，
裂解时冰上放置。
4. 分离上清。5000rpm，4min，4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm，
10min，4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5微5*SDS loading buffer混匀，煮沸10min。
5. 重悬包涵体。 用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微
5*SDSloading buffer，煮沸10min。
6. 正负对照的收集。离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40μl,加入10μl5*SDSloading
buffer,煮沸10min裂解。
7. 跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: -,+,上清,包涵体.
附件3
蛋白浓度定量测试方案
1．将染色剂稀释。
稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44μm的滤膜过滤于另50ml离心管中。(此剂量可测4个样品。)
2．牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备
1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500μl/支(可以
室温放置60天，-20度长期保存)。
2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180μl，另外加一管水为
3．染色。
1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。4个
梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品(或1+n个样品)和1个blank，共10支EP管(或10+n支)，分别对应标记。
2）将30μl样品和30μl标准BSA及30μl H2O分别加入上述EP管中。涡旋混匀。
3）室温孵育5min到60min。5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为
Absorbance wil increase over time。
4. 吸光度的测量。 600nm处测量，并记录吸光度。注意：1. blank是染色液加30微升的水。
2.从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测量顺序。
5. 比色皿的洗涤。 用100%乙醇浸泡洗涤。
6. 标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。 附件4.
4ml millipore超滤离心管使用注意事项
1. 用前用miliq 水润湿。
2. 4度预冷。
3. 离心力不能超过7500g。加速度设定为8.
4. 离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一
致。
5. 使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存。
如果要短期保存几天，也可加水浸泡。
附件5
聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法
附件6.
包涵体蛋白的提纯
与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后，离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中都含有6M尿素或盐酸胍。另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。
如果要做包涵体，建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去，除去后蛋白可能就析出了。尿素毒性相对较小，可以不用除去。这样可以省去很多麻烦。尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解：6mm变幅杆，15%功率，3s/6s，10min左右即可。也可以加上1%---5%的甘油助溶。甘油是加在Equilibration Buffer中的。
另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0.6左右。
乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE
1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl 100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。
2、-20度放置10min。4度，15000rpm，10min，小心弃去上清，尽量去干净。此时管底可见蛋白沉淀。
3、向管中加30μl 1.5*SDS-loading buffer。（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。
4、上样，跑胶。
如有错误，敬请批评指正。
血清的提取
动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g，10min离心，分离出血清。
抗血清保存有三种方法：
第一种是4℃保存，通常可保存3个月～半年，效价高时可保存一年左右；
篇二：WB完整步骤
Western blot 步骤： 配胶
制胶
跑胶
转移胶（转膜）
封闭和孵抗体
一.配胶
这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度）
2.浓缩胶
均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）
PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，
二制胶
1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。30分钟
胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴
10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉 过硫酸铵（APS）(10%;w/v)
取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制
但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气
2.灌积层胶5%（统一） 40min
说明：可延长，宁长勿短。防止凝固不均匀，形成月牙状。
三．跑胶
1.配制running buffer
1) tris 3g；
2) Glycine:甘氨酸14.4g
在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键 的。Tris-甘氨酸系： 统是目前使用最多的缓冲系统。
如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-(转 载于:wWW.cSsYq.cOM 书业网:蛋白跑胶步骤)尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。 甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程
3) 10%SDS 10ml；
SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为 特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分 子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它 的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
4) 加双蒸水ddH2O至1000ml 不需调节pH
2.上样
上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。
所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积
3.电泳
加running buffer
其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳running Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。
电压及时间：70V 40min 大约到分离胶与浓缩胶的交界处。
100/120v90min
当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。
电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物
溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.
样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。
低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通
以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳
注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，
四．卸胶
注意胶勿破！可根据自己所需要蛋白的大小选择胶的范围，maker为标志。
五.转移胶（转膜）
由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响
切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。
1. trans buffer电转移缓冲液调Ph
1) tris 5.8g
2) 甘氨酸 2.9g
3) SDS 0.37g
4) 甲醇 200ml
转移缓冲液中都含有适量的甲醇，对于分子量较小的蛋白质，甲醇能促进它们固定在固
相纸膜上，但对于大分子量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，在转移缓冲液中是不宜加入甲醇的。因甲醇使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白质从凝胶中转移出。由于甲醇能将结合在碱性蛋白质上面的SDS解离出来，而使其带正电或呈电中性，蛋白质也就更难从凝胶中转移出。
在印迹转移中，转膜成功与否，直接关系到整个Western Blotting 的成败：其中转移缓冲液，膜的选择至关重要。要使蛋白质组分能有效地从凝胶转移到固相纸膜上,缓冲液的pH很重要。有些分子量并不是很大的蛋白质区带，即使延长电转移时间也不能从凝胶转移到固相纸膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态所造成的，因此应适当改变转移缓冲液的pH以利于转膜。此外，膜的选择也很重要.硝酸纤维素NC膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜，重氮化膜和阳离子尼龙膜为最常用的膜，硝酸纤维素NC膜使用得最普遍。因其价格便宜，使用方便，吸附蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测。它的缺点是：与蛋白的结合为非共价性，膜干燥后很脆，易碎。重氮化膜则与蛋白形成共价结合，有较好的机械强度，但它只能在那些没有游离氨基的凝胶缓冲液中使用。阳离子尼龙膜与蛋白是通过离子键结合的，其结合容量很大，尤其对分子量较小的蛋白质结合特别有效。它有极好的机械强度，在冲洗和干燥中膜的大小不发生改变。PVDF膜是用来吸附从各种凝胶中转印的蛋白质的最佳用膜。这种疏水膜呈均一控制的孔结构，具有极强的吸附生物分子的能力。与硝酸纤维素膜相比，Immobilon-P膜具有易于操作，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高的特点，提高了检测的灵敏度。其开放的孔结构使其容易接近被吸收的蛋白质，并去除背景上没有吸附的探针。可以说，它是免疫检测理想的印迹膜。此外，膜的孔径的大小也是需要考虑的重要因素。对于分子量大于20kD的蛋白质，需要选择0.45um的膜，分子量小于20kD，需要选择0.2um的膜。分子量小于7kD，需要选择0.2um的膜。有的蛋白质由于分子量太大，而很难转膜，针对这种情况，PIERCE专门推出了在胶上做Blotting的试剂盒。
将PVDF膜先在甲醇中浸泡几分钟,再转移到转膜缓冲液中处理15min。
PVDF膜，125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）
另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）
篇三：WB操作步骤
Western Blotting试验步骤
一， 组织蛋白提取
1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。
注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。
2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。
注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。
3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二， 提取液中总蛋白的测定
用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。
1. 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体
积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。
注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔，
2. 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微
升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。
3. 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。
4. 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm，使用温箱孵育时， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。应注意防止因水分蒸发影响检测结果。
样品蛋白布板：
空白对照布板：
注：测蛋白浓度过程中，可将剩下的蛋白样品存放于4℃。待浓度测完，可拿一部分蛋白样品分装，5×SDS缓冲液，于沸水中煮5-10min使蛋白变性（也可以使用PCR仪进行变性，99℃，3-5min）。此处需确定待加入5×SDS的量。计算含20-50ug蛋白样品的溶液体积即为上样量。先根据所算出来的蛋白浓度确定含20-50ug蛋白样品的溶液体积，再按蛋白样品：5×SDS上样缓冲液=4:1（此时5×SDS的浓度为1×）的比例算出5×SDS的加入量。等算出这个，可以把蛋白样品按这个量分装好冻到-80℃，跑电泳时可以直接拿出来用已知蛋白含量的变性样品。
三，SDS-PAGE电泳
1. 制胶（分离胶8%，浓缩胶4%）（见附表）
2.清洗玻璃板，晾干备用。（洗衣粉-自来水-蒸馏水，至不挂水珠为止）
3．灌胶：在光线明亮处，装好垂直电泳槽模具，检验玻璃板不漏胶（可先灌进去一点分离胶，稍等片刻，观察其是否漏），用1ml移液器在玻璃板夹层中沿玻璃板一角缓慢添加分离胶（5ml），至玻璃板中上部，需缓慢进行，以确保玻璃板中无气泡产生。灌完分离胶后往玻璃板中继续添加超纯水，使制胶版完全被超纯水封闭。静置45min
（20-30min?），直至在超纯水与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线。将制胶版略微倾斜，用移液器吸出超纯水，并用吸纸吸去制胶版板壁上残留的水滴。用1ml移液器在制胶版右角上缓慢添加4%浓缩胶（2-3ml）至制胶版被完全封闭。将梳子垂直插入制胶版浓缩胶中，用移液器向梳子缝隙中缓慢加入浓缩胶，至空隙被完全填满。室温静置约50min，直至在浓缩胶与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线，将梳子缓慢垂直取出并将制胶版用电泳夹夹好放入电泳槽。 3．加足够的电泳液（加至淹没内面玻璃板）后开始准备上样。 4.上样
（1）蛋白变性：含20-50微克的蛋白样品中加该蛋白体积的1/4量的5×SDS上样缓冲液，装于200微升EP管中，混匀。插在小孔泡沫板上（管口不要离水面太近，盖子盖紧，不用封口），沸水煮5-10min,使蛋白变性，离心15-30s混匀。
（2）加样：用50ul的微量加样器上样，注意需缓慢轻柔，一次性加完，防止气泡产生或损坏凝胶，加每个样品前需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。
5.跑电泳：按黑红电极盖好电泳槽盖子。调节电压，浓缩胶：80-100V，（80V,20min）分离胶180-200V(100V 120min），及时观察防止条带跑出胶。
注：此过程发热，放入冰水浴中进行。待溴酚蓝迁移至凝胶最下端时，电泳完毕。（跑胶位置因目的蛋白的大小而异）。
四，转膜
1. 准备：制冰，和胶同等大小的PVDF膜一张（用甲醇侵泡10s，10min?），滤纸6张（也可以用2张？），将滤纸、夹子、海绵垫（2张）、玻棒浸放于加有转移液的搪瓷盘里。切膜和滤纸时需佩戴手套。
2. 将夹子打开，使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以排除气泡。将胶从玻璃板中剥下来，按海绵-2层滤纸-凝胶- PVDF膜-2层滤纸-海绵的顺序（每对齐覆盖一层，均需固定好位置排除气泡一次），合起架子并固定。
3. 将“三明治”放入转移液槽中，使夹子黑面对黑面，白面对红面，盖好盖子，接通电源，100V 2h，放入冰水浴中转移。
4. 拆下转移装置，用TBS从下向上浸湿转移好的膜，移至含有封闭液的平皿中（加盖防止水汽蒸发），室温摇床上封闭1h（2h或者4度过夜？）。
注：封闭液：2.5g奶粉+50mlTBST，混匀，现用现配。
5．洗膜：TBST溶液漂洗膜3次，10min/次（就是把TBST放平皿里，然后把膜浸泡在其中，摇床摇十分钟）。-有说封闭后不用洗膜 6.孵一抗：将一抗用TBST稀释至适当浓度，1:1000,10ul一抗+10ml稀释液（稀释液：2.5g脱脂奶粉/BSA+50mlTBST）,将膜放入倒入一抗的表面皿或者培养皿，室温孵育膜2h。
注：稀释的一抗里可以加入0.002g的0.02%叠氮化钠，可在4度长期保存，可是供货商建议仍然-20保存？ 7.TBST洗膜3次，10min/次。
篇四：SDSpage配胶跑胶注意事项
配胶跑胶注意事项
1、 配胶前检查玻璃板是否干净、配胶用量杯是否干净
2、 准备好试剂，把试剂按顺序摆好，其中30%聚丙烯酰胺、TEMED在4度冰箱，10%AP
在-20冰箱中，提前取出化冻。
3、 根据配方准备1000、100、10微升的枪。
4、 夹玻璃板：注意夹紧，上架后可用1000的枪头顶住上夹，但也不要顶的太紧，注意观
察玻璃板下缘的海绵是否平整。
5、 准备好后开始配胶。水、30%聚丙烯酰胺、TRIS酸加好后就要混匀一下，加了AP、SDS
后也要混匀一下，混匀时要尽量避免产生气泡。最后加TEMED后混匀约1分钟，混匀是要把枪调到1000，混匀是上吸要注意不要吸空。
6、 加入玻璃板，加入时尽量不要有气泡，加到夹子中间绿柱子的下缘处，如果你有把握玻
璃板不漏，可以少加点。
7、 1000的枪加无水乙醇压面，加时一定要慢一点。等待分离胶干，大约20分钟。
8、 把乙醇倒掉，吧夹子侧过来放置，再用吸水纸轻轻吸干乙醇，避免碰到胶面。
9、 配制浓缩胶之前准备好上样梳子，注意1.0的和0.75的分别，擦干净备用。
10、 配制浓缩胶同配制分离胶，加到上口后，加胶事一定不能有气泡。立即插入梳子，
插入时要一步到位，不能左右上下移动。插好后可以用枪在两边补点胶。等20分钟左右备用。
11、 跑胶：上电泳槽夹板时一定要平整，不能一边高低，否则漏液。夹好后加入1*电
泳液看看是否漏液，如无漏液，则可用，
12、 拔梳子：一定要慢慢的垂直向上用力，不能左右歪。否则把柱子弄歪了，不能上样，
这可是有血的教训的。
13、 上样：marker在-20冰箱中，如有多块胶，可以把mark放在不同位置，以示区分。
上样时注意慢慢的加样，不能把各孔之间污染了。书面记录加样顺序和marker的位置。
14、 跑胶：上架，注意黑对黑，红对红，外槽加电泳回收液，加至2gel处即可。上盖，
也要注意对上颜色，通电，电压80v把marker跑出来后调电压至120v。跑30-40分钟就差不多了，主要注意跑道下缘位置。
15、 下架，切胶：用切角板小心撬开两块玻璃，然后上缘沿分离胶和浓缩胶之间切开，
下缘沿marker的最后一条绿线切下，当然下口切的时候要考虑你的目的蛋白的分子量大小，如果很小，适当的往下切一点。
16、 烤染：把切好的胶小心的移到玻璃碗中，加考马斯亮蓝染液，上机染色大概一个小
时，回收染色液，加入脱色液，一个小时，换脱色液，在脱色半小时即可。
17、